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宏转录组用于监测虫媒病毒的研究

宏转录组学(总RNA测序)可实现样品中病毒的非靶向,高通量检测和鉴定。它可以用于检测已知病毒和新型病毒,同时提供完整的基因组信息,使其成为功能强大的监测工具。宏转录组学已用于多种监测项目,包括检测人类污水中的病毒,监测无脊椎动物中间宿主(例如蜱)和脊椎动物中间宿主(如蝙蝠)中的病毒,以及在爆发期间溯源病毒株。宏转录组学在一系列监测应用中的成功应用表明它具有提高当前虫媒病毒(节肢动物传播的病毒)监测程序的潜力。

虫媒病毒对人类和动物健康构成重大威胁,其中包括登革热,黄热病,寨卡病毒,基孔肯雅热,蓝舌病和马脑炎病毒等病原体,仅登革热病毒每年就感染约3.9亿人。病毒监测可作为增加传播风险的预警系统,并采用诸如诱捕蚊子,在细胞培养中分离病毒以及使用定量PCRqPCR)分析进行靶向分子病毒检测等手段。宏转录组学是一种非靶向方法,为虫媒病毒监测提供了许多优势。它可以在不进行培养的情况下检测病毒,不需要先确定病毒序列,可以识别新的虫媒病毒威胁,阐明混合感染,并可以为暴发的分子流行病学调查提供完整的基因组序列或特定的蛋白质序列。此外,它可以检测蚊子群中的其他生物,包括共生菌和寄生虫(如利什曼原虫)。

为了将转录组学用于虫媒病毒监测,必须首先认证监测蚊子群方法的敏感性和特异性。许多研究已经使用宏转录组学方法通过IlluminaIon TorrentOxford Nanopore测序来检测单个蚊子中的病毒。更多的研究是对蚊子群体进行测序,群体的样本数从5个到6700个标本不等。这些研究主要集中在探索各种蚊子种群中存在的病毒多样性。但是,大量蚊子用于虫媒病毒监测时,缺乏有关宏转录组学金标准测试指标(例如敏感性和特异性)的研究。在评估传播风险和了解病毒丰度的时间变化时,这一点至关重要。病毒载量和测序结果之间的关系需要明确,以避免对序列数据的错误解读,从而导致假阳性结果(检测到蚊子群中不存在病毒)和蚊子群中存在的病毒的假阴性结果(检测失败)。

实验室工作流程会大大影响宏转录组测序检测蚊子中虫媒病毒的能力。一种提高灵敏度的流行方法是使用过滤,PEG沉淀或不依赖序列的扩增方法来富集虫媒病毒。尽管这确实增加了病毒序列的数量,但富集也会引入偏向bias。增加病毒序列数量的另一种方法是消耗蚊子RNA,通常是靶向丰富的核糖体RNArRNA)去除。有多种rRNA去除试剂盒可采购,但是这些试剂盒并非特定于蚊子的,因此需要采用基于蚊子rRNA序列的定制探针。

来自澳大利亚的科学家采用Nugen的蚊媒RNA测序文库构建试剂盒(特异性去除蚊子rRNA探针)验证了高通量基因测序(NGS)技术蚊子中虫媒病毒的敏感性和特异性。为了对此进行评估,将罗斯河病毒(RRV)和Umatilla病毒(UMAV)分离株的五种稀释度(11120140018,0001160,000)掺入100个样本群的子样本中南方库蚊(Culex australicus)蚊子。 11稀释表示100只蚊子池中一只RRV感染的蚊子的病毒载量。科学家对子样本进行了核酸提取,蚊子特异性核糖体RNA去除和Illumina HiSeq测序。科学家还使用数字PCRRT-ddPCR)和定量PCRRT-qPCR)测量了子样品的病毒载量。转录组测序在111201400子样本中检测到RRVUMAV。正确识别了100%的RRV99.6%的UMAV组装序列,实现了高特异性。宏转录组测序不如RT-qPCRRT-ddPCR灵敏,但是它得到了全基因组序列并检测到其他19种病毒,其中包括澳大利亚的四次*发现的病毒。这些发现将有助于虫媒病毒监测计划在常规监测活动中利用转录组学来加强虫媒病毒的检测。

之后,澳大利亚科学家采用这种方法在蚊子中发现了Yada病毒。 

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