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流感病毒基因序列变异的NGS监测方法

流感病毒感染包括人类在内的许多鸟类和哺乳动物,并且由这些病毒引起的感染具有重大的公共卫生,动物卫生和经济意义。甲型流感病毒(IAV)在遗传和抗原上都极为多样化,并广泛分布于的野生禽类,家禽和哺乳动物以及人类中。有两种主要的表面糖蛋白,血凝素和神经氨酸酶,具有多种亚型。在144种可能的HA-NA亚型组合中,至少有131种已在NCBI流感病毒数据库中从禽类中分离出来的菌株中进行了确认。对流感的监测,快速诊断,传播,发病机制和疫苗学的持续研究对于预防和减轻其影响至关重要。

流感研究的一个关键方面是检测流感病毒的类型,亚型和基因型,并对其进行分类,特别是对于不同样本(例如野生鸟类,家畜和人类患者)中新出现的病毒变异要进行监测,预防和治疗。技术进步允许开发新的方法来鉴定来自各种样品类型的流感病毒分离株,包括基于培养,抗体结合,血清学测定,基因扩增和基因测序方法。比较全面的检测方法仍然是采用高通量测序技术。由于典型临床样品中病毒RNA的数量较低,所有这些研究都采用了病毒特异性引物和病毒特异性PCR扩增策略来捕获目标流感序列。然而近在下一代测序(NGS)中越来越多地强调PCR引入的错误。目前已经显示常用的PCR酶,包括高保真酶,均具有10-510-6点突变/ bp /重复的错误率。除了特征明确的聚合酶碱基取代错误外,还发现其他错误同样普遍,包括PCR介导的重组,模板转换和温度循环过程中引入的DNA损伤。使用PCR捕获源自流感病毒RNAcDNA的另一个挑战是分离的流感RNA可能已被降解,因此难以通过需要全长片段作为模板的流感通用引物进行扩增。在许多场合下,无法使用亚型特异性引物,因为样品中流感病毒的类型或亚型是未知的。

美国NIH设计了一种针对所有流感病毒株的捕获探针。利用所有可用的甲型,乙型和丙型流感病毒序列,获得了用于设计通用流感捕获探针集。但探针捕获的前提是需要有足够的cDNA才可以实现,同时避免使用PCR引入的错误。 因此,美国NIH采用了Nugen公司的Ovation RNA-seq V2试剂盒来富集病毒的cDNA 该试剂采用了Ribo-SPIA技术,只需4.5小时,即可从500 pg-100 ng RNA中获得高质量的cDNA样品。对于降解的样本(如RIN 2.4)的样本,同样会给出惊喜的结果。Ovation RNA-Seq System V2以简化的工作流程提供了更高的转录本覆盖和均一的测序序列分布。 SPIA技术是取代PCR扩增的一种技术,其原理是单引物的扩增, 同时扩增保证每次的模板是样品模板,不同于PCR扩增模板可能是上一轮的扩增产物。 SPIA扩增产物无偏向,可用于基因表达差异分析,因此可呈现样品的原始比列状态。将该方法应用于从野鸟场监视收集的泄殖腔拭子样品中,发现这些样品中的IAV序列和亚型是传统方法无法检测到的。

随后,NIH使用病毒靶向杂交捕获对来自接受GMP制成的A型流感/加利福尼亚/ 04/2009H1N1)攻击的15位志愿者和52009年大流行的自然感染流感患者的鼻洗样本进行了深度测序。在挑战病毒中发现了十个单核苷酸多态性(SNP)位置。在攻击患者和自然感染患者中发现了许多SNP位点,其中许多以前未发现。鉴定出的SNP和进化树分析表明,在挑战参与者和自然感染的患者中病毒的宿主内部进化是不同的。这项研究使用PCR Free的杂交捕获技术,提供了一种准确无偏的评估方法,用于评估人体内从统一的流感接种剂到宿主体内不同病毒的进化,并与自然感染的患者进行比较。

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