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浅析梯度PCR基因扩增仪的工作原理
  梯度PCR基因扩增仪能满足不同工作环境的多种需求。可用作以聚合酶链式反应为特征的、以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析。基因扩增仪广泛应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域。
 
  1、基因扩增的基本要素:
 
  基因扩增的基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。
 
  ①DNA模板:待拷贝的DNA称为模板,它可以是双链DNA也可是单链DNA,最后扩增得到的产物是双链状态的。
 
  ②引物:是DNA复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
 
  ③DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶):是DNA复制的动力,在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。
 
  ④缓冲液:提供DNA合成反应所需的pH,离子强度等环境。
 
  ⑤4种单核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料。
 
  2、梯度PCR基因扩增仪原理:
 
  梯度PCR基因扩增仪是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成,用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。
 
  PCR反应一般设置20~40次循环,每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高,如果循环次数是30次,那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下:
 
  ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
 
  ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
 
  ③引物的延伸:温度升到72℃左右,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
 
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