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2019新型冠状病毒是如何通过高通量基因测序在临床样本中被发现的?

2019年12月开始的新型冠状病毒肺炎(NCP)正在国内大规模流行,成为影响全社会的公共卫生事件。国内的科研机构迅速行动,在短时间内获得了新型冠状病毒(2019-nCoV)的全基因组序列。无论是从治疗的角度还是从流行病学的角度来说,对于疑似病例的诊断都有着极其重要的意义。

来自武汉和广州的研究人员报道了他们用高通量测序技术(NGS)从2名武汉大学中南医院疑似患者的支气管肺泡灌洗液(BALF)中鉴定2019-nCoV的过程,并发表在了新一期的Emerging Microbes & Infections上。

事件还原:

2020年1月2日从两名患有非典型肺炎的患者中获得了支气管肺泡灌洗液BALF样本。

2020年1月3日进行SARS特异性RT PCR检测,产生部分RdRp片段,并揭示了潜在的病原体。

2020年1月4日扩展RdRp片段并获得更多的基因组片段,并开始准备mNGS RNA

2020年1月5日完成了mNGS RNA文库的制备。

2020年1月6日开始在Miseq平台上进行mNGS测序。

2020年1月7日接收测序数据,启动病原体鉴定流程,获得病毒基因组,确定2019-nCoV为病原体,终的CoV基因组为29,881 nt。

2020年1月8日进行基因组比较和进化分析。

自2020年1月3日起,即时进展报告已发送到中国疾病预防控制中心(CDC),在病原体鉴定方面取得的每个进展保持同步。

和现在常用的核酸检测手段——RT-PCR相比,NGS有着不可替代的显著优势。RNA-Seq可以检测生物体内的“感染组”,如RNA病毒、DNA病毒、细菌、真核生物等,因为除朊病毒外的病原体都可以表达RNA。RNA-Seq不仅可以检测,而且还能揭示病原体丰度、变异情况、基因表达等信息。

目前,NCP病死率比较高的患者主要分为两类:老年人和有基础病的患者。有基础病的患者感染2019-nCoV之后可能会加重基础病,例如继发细菌感染,从而使病情恶化。有些患者的免疫反应非常强,过激的炎症因子风暴非常危险。上一段中提到的RNA-Seq的优势此时就能帮助医疗人员判断病情,提供个性化治疗。

患者139岁男性,患者2为21岁女性。2名患者入院后接受了进行了影像学检测,结果显示,2名患者的肺部均可能发生了病毒感染随后的常规抗病毒和抗感染治疗并未缓解其症状。之后2名患者接受了常规病原检测,均为阴性RT-PCR检测显示发现的病毒与SARS-Cov无关。

在常规病原检测的同时,研究者收集了2名患者的支气管肺泡灌洗液(BALF),从中提取了总RNA,由于总RNA浓度太低,低于Qubit核酸分析仪定量0.5ng/ul的测量下限了,所以研究人员采用Nugen的Trio RNA-Seq微量样本建库试剂盒进行了文库构建,并在MiSeq上进行PE150测序,在24 h内各获取了2名患者的7.34M和4.52M reads。测序数据显示样本中病毒的丰度*:平均基因组覆盖率分别为523.6X和133.7X,估计的丰度水平分别是患者1和2测序总序列的1.5%和0.62%。生物信息学分析发现,2名患者的几乎全部病毒reads(分别为99.9%和99.7%)都属于2019-nCoV。进一步分析发现,虽然数据中存在单核苷酸多态性(SNP),但2名患者所感染的是同一冠状病毒,被分别命名为2019-nCoV毒株WHU01和WHU02。

研究者在建库阶段采用了Nugen公司的Trio RNA-Seq建库试剂盒,Trio整合了Nugen三项技术

  • AnyDeplete技术,能够定向去除人体宿主rRNA,提高信噪比,,减少背景序列干扰。
  • 单引物等温扩增(SPIA) 技术,可以无偏倚地从有限和降解的样品中扩增RNA。
  • DimerFree技术,使建库过程中不产生引物二聚体,文库更高效、可靠。

 

在这项研究中,相比于普通的RNA-Seq,Trio的*优势极大地帮助了科研人员:

由于使用AnyDeplete技术去除了人核糖体RNA(噪音),病毒reads(信号)所占比例大大提高,而且可以从转录水平上与宿主自身的RNA相比较。2名患者的2019-nCoV reads分别占测序总数据的1.5%和0.62%,丰度非常高,超过了表达比较高的宿主基因,是2019-nCoV正在宿主肺部活跃复制的铁证。

呼吸道疾病患者的BALF可能比较粘稠,富含蛋白质,而且来自2019-nCoV疑似病例的样本要首先经过56°C30 min灭活,才能进行后续的RNA提取。以上这些情况增加了RNA提取的难度,会导致提取到的RNA量少、质量低。而Trio的SPIA技术可以无偏倚地从有限和降解的样品中扩增RNA,保证了后续建库的成功率和转录丰度的保真性。

参考文献:

Liangjun Chen, Weiyong Liu, Qi Zhang, Ke Xu, Guangming Ye, Weichen Wu, Ziyong Sun, Fang Liu, Kailang Wu, Bo Zhong, Yi Mei, Wenxia Zhang, Yu Chen, Yirong Li, Mang Shi, Ke Lan & Yingle Liu (2020) RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 313-319, DOI: 10.1080/22221751.2020.1725399

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