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NGS液体活检诊断病原感染

病原微生物的检测是感染类疾病的诊断治疗中*的重要环节。

      传统的病原微生物检测方法分为培养和非培养两类,临床公认的金标准是分离培养和生化鉴定,这种方法的操作周期长、失败率高,并且不是每种病原体都可以培养。相比之下,不依赖培养的镜检、抗体抗原免疫等方法,在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强,但在准确性上存在明显劣势。

      近年来,基于核酸检测的分子诊断技术发展迅速。基于PCR的方法直接从样本中识别微生物可以加速鉴定,但这些测试仅包括少量病原体,在选择测试之前需要进行推定诊断,仍然不能满足的临床需要。

然而,大量的重症感染病例由于不能得到及时的诊断和治疗而延误病情,造成不可挽回的严重后果。如何才能实现快速,高效,精准,无创,广谱定性的病原检测已成为临床医学追求的目标。

      cfDNA检测技术让这一希望得以实现:这种非侵入性诊断技术目前在在胎儿异常诊断、移植器官排异检测及癌症的表征及检测中已得到大量应用,而在病原感染检测中,cfDNA检测技术可以实现血浆中不同位置感染的病原体DNA的片段检测,实现无创检测多种感染的可能。

      脓毒症,一种因感染导致组织和器官损伤,进而造成的全身性炎症反应。每年有近3000万人会感染此类疾病,其中超过1800万为严重病例,800万人会因此丧生。早期的发现和适当的治疗在脓毒症预防和控制方面意义重大。

   2019年,著名学术期刊《Nature microbiology》报道了一例利用cfDNA技术检测脓毒症病原的实例,工作流程如下图:

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     基于此技术,病原微生物的临床可报告范围(CRR)有了极大拓展,可包括(1DNA病毒,可培养细菌,其他条件苛刻和不可培养的细菌,分枝杆菌,文献中的真核病原体;(2)在已发表的病例报告中引用的病原体数据库;(3)从临床分离测序获得的参考基因组以及已报道的致病性病原。

     这其中,快速精准以及低微核酸起始量(10pg-100ng)的测序文库构建,得益于Tecan*的Ovation Ultralow Library System V2 文库构建技术,该技术广泛适用于各种类型的核酸样本建库,尤其在面对cfDNA检测的超低起始量时表现良好,并能在3小时内完成简单,自动化的建库过程,并能应对各种GC含量的高保真扩增。技术路线如下:

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Ovation Ultralow Library System V2可应用于各种类型的测序研究,包括:全基因组测序、外显子测序、ChIP-seq、微生物组研究,液态活检,石蜡包埋样本(FFPE)等。建库过程中不会产生接头二聚体(见下图,与竞品的比较)。

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效果稳定,不受核酸起始量影响:

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GC含量的样本中也能有稳定出色的表现:

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在《Nature microbiology》的脓毒症cfDNA病原检测研究中,Ovation Ultralow Library System V2大放异彩。研究中利用350名败血症患者,166份未发现明确脓毒症的样本开展cfDNA的提取,运用二代测序检测技术,鉴别并定量血液中1250种与临床相关的细菌、DNA病毒、真菌和真核寄生虫,可利用血液中游离微生物DNAcfDNA),准确、快速地诊断多种感染。

研究中的cfDNA病原微生物检测,可以实现高度敏感(灵敏度LoD &小检测量 LoQ)的病原微生物检测,广谱病原检测可报告范围使cfDNA病原检测技术具有更广泛的敏感性:在不用含量血浆DNA检测中均有出色表现,结合临床验证,125次模拟中有121次正确检测,灵敏度达97%:阳性预a-c测值(Ppv)达99%,与预测的95%高度一致(图a-c);

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      该技术可实现病原的精准检测,在实验模型中进行检测精准度研究发现,快速检验测试中的重复测量,个体微生物的平均变异系数为21.1%±13.6%),与实验室内的检测精密度相当。

      由于个体间cfDNA中病原成分的差异,在使用临床样本时难以准确区分cfDNA中低水平存在的环境污染DNA。所以研究利用重复测量评估了这种方法检测的分析特异性(下图)。在被测试的50件复制品中,意外的微生物cfDNA仅在一次复制中检出,总特异性为98%;以不同比例混入混入菌株检测,检测值与预期也保有良好一致性,同时证实了密切相关物种共感染造成的干扰极低。

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     为了评价血浆来源的微生物cfdna作为广泛感染病原体的生物标志物的有效性,研究亦将微生物cfDNA测序结果与病原体鉴定结果进行了比较(下图)。与原血培养相比,cfDNA技术敏感度可达93.7%,同时cfDNA技术提供了物种级鉴定的灵敏度和速度

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       血液游离微生物DNA测序,有望作为非侵入性检测方法用于感染疾病检测。而快速高效高灵敏精准的建库技术则是临床病原体检测诊断的核心。Ovation Ultralow Library System V2技术,完美将快速建库,低核酸起始量背景,高精准测量要求整合,满足了多种研究和样本类型的建库要求,为科学研究及临床医学应用提供了强有力的技术支撑。

 

参考文献:

Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nature microbiology,2019.

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