基因分型技术新突破：Allegro靶向基因分型技术详解

基因分型（Genotyping）是利用分子生物学方法检测生物个体基因型的技术，在医学和农业生产中，具有广泛的应用价值：在农业领域，常用于进行形状基因的精细定位、分子辅助育种、种质资源鉴定等等；医学领域常用于分析诊断疾病导致的遗传变异，分子遗传机制、易感性位点筛选及药物敏感位点筛选等。

目前常用的基因分型手段主要是基于NGS的简化基因组方法，包括GBS、RAD、ddRAD等，这些简化基因组方法都能够提供开放、无偏差的基因分型，但却没有一种技术可以实现针对靶向基因区的高效分型——单基因、基因家族、启动子和增强子、基因簇及非编码基因等都可能含有重要的与表型变异密切相关的多态性。因为传统的简化基因组技术，由于其以随机的方式研究遗传变异，获取的信息大部分在这些区域之外，就导致了有价值标记的检测缺失。虽然经典的微阵列的方法可以规避这一缺漏，但却存在着当基因池改变时会出现较强的检测偏差和较差的可重复性问题。

让我们来了解一种两全其美的新方法：

Allegro靶向基因分型，提供了一种快速、可扩展、高效经济的单引物富集技术（SPET），基于新一代测序技术对各类生物样本的特异性靶向区域SNP进行有针对性的测序分型。该方法可以通过捕获每个靶向测序序列的SNP特异性数据点，提供丰富有效的测序数据，不仅有效获得靶向区分型结果，更可以快速构建具有可扩展性及低成本单SNP位点检测流程。

技术流程如下：

1. 将基因组酶切打断，该步骤操作便捷，可实现自动化；

2. 将片段化的基因组接上indexed adaptor ，DimerFree技术可消除接头二聚体的形成;

3. 针对靶向区域设计的探针捕获目标区域捕获；

4. 扩增后获得靶向区域序列文库，测序后得到分型结果。

Allegro靶向基因分型通过探针设计及“鸡尾酒”式的酶切组合进行基因组片段化，能够有效地将SNP控制在测序读长范围内，辅以优化过的探针设计，确保SNP可通过单端测序测序模式检出。退火位点的设计也规避了已知多态性位点的位置，以确保扩增过程不会因此而造成偏倚。如果选择双端测序测序，还可在read 2中获得新的未知多态性位点信息，充实研究结果（下图）。

Allegro靶向基因分型的优势如下：

• 方便在自动化工作站上建库
• 设计灵活
• 可扩展复用
• 检测准确
• 集成了酶促打断
• 低起始量（10 – 1100 ng）
• 高检测通量（100 – >100,000 SNPs）
• 建库周期短（<24 h）

截至目前，已有包括人，动物，植物在内的多个物种开展了基于SPET技术的基因分型。

今天跟大家分享的是该技术在黑杨及玉米的研究中的应用实例：

为了评估SPET技术的分型效果及技术性能，研究对10个玉米株系（5个近交系 F7, H99, HP301, Mo17, W153R; 5个杂交F1：A632XB73, B73XF7, W153RXHP301, B73XB96, B73XMo17）同时开展了基于illumina MaizeSNP50芯片分型的研究和SPET分型，并对540株黑杨构成的自然群体进行SPET分型及Panel分型研究，以获得与生物量表型相关的位点信息。

玉米研究中发现，全部样本中目标位点的覆盖度十分相似（约50×，下图A），通过提高覆盖度阈值，检测的准确性有改善，在50×到达的平台期后，准确率可达97.2%（下图B）。分析结果比较显示，无论在准确度和可重复性方面，自交系个体都比杂交系个体呈现更好的结果（下图C、D）

针对黑杨的大规模基因分型研究中，采用SPET技术，靶向实现了目标区域的捕获分型，共捕获靶向位点数66922个，并且在非靶向区域内获得了453170个非靶向多态性位点。等位基因频率研究发现，目标区域位点等位基因频率在一定程度上与应用的选择标准有关（下图），de novo方法侧重*或极低的等位基因频率。

对不同方法获得的SNP分型结果进行样本间聚类，发现de novo方法可增强样本群体间聚类的性能，更好的体现出差异性类群。（下图）

综上，Allegro靶向基因分型的SPET技术一次性突破了旧基因分型技术的瓶颈，将靶向捕获研究与可拓展性的简化基因组相结合，是一种可靠高效低成本的基因分型技术流程。在实现了可拓展研究的同时，缩减了实验耗时。这些优势弥补了此前微阵列技术和简化基因组技术的不足，为大规模群体的稳定靶向基因分型提供了具有高性价比的技术手段。

主要参考文献：

Single primer enrichment technology as a tool for massive genotyping: a benchmark on black poplar and maize. ANNALS OF BOTANT, 2019.