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链霉亲和素包被微孔板的基本操作方法
链霉亲和素包被微孔板是预先将链霉亲和素固定在聚苯乙烯微孔板表面的预制微孔板,广泛应用于生物检测实验中,核心利用‌链霉亲和素-生物素‌高亲和力结合的特性,用于固定生物素化的分子探针。
链霉亲和素对生物素具备亲和力,结合常数可达到10^-15mol/L,且每分子链霉亲和素可结合4个生物素分子,反应稳定快速,因此可以通过提前包被链霉亲和素,一步法固定生物素化的抗体、肽段、寡核苷酸等捕获分子,大幅简化实验流程。
实验前准备:
提前从4℃冰箱取出微孔板,平衡至室温(约15-30分钟),未使用的微孔立即放回密封袋,4℃密封储存,避免受潮。
准备好实验所需试剂:生物素化捕获分子(抗体/肽段/核酸探针)、待测样本、洗涤液(一般为含0.05% Tween-20的PBST缓冲液)、封闭液(可选,若出厂已预封闭可省略)、检测标记物(酶标/荧光标记二抗)。
通用操作步骤:
‌结合生物素化捕获分子‌:将生物素化捕获分子用合适缓冲液稀释至工作浓度,每孔加入‌100μL‌稀释后的捕获分子,室温孵育30-60分钟(部分小分子探针可4℃孵育过夜),利用链霉亲和素-生物素的亲和力完成固定。
‌洗涤去除未结合分子‌:孵育结束后弃去孔内液体,每孔用200-300μL洗涤液洗涤3次,每次浸泡30秒,洗去未结合的游离捕获分子,拍干孔内残留液体。
‌封闭(可选)‌:若出厂未预封闭,或实验对降低非特异性结合要求较高,每孔加入200μL 1-5% BSA封闭液,室温封闭1-2小时,随后洗涤3次拍干;出厂已预封闭的产品可省略此步。
‌捕获待测靶标‌:加入稀释好的待测样本或标准品,每孔100μL,室温孵育1-2小时(或按照实验方案调整时间),让靶标与固定好的捕获分子特异性结合。
‌洗涤结合检测抗体‌:弃去样本洗涤3次拍干,加入酶标/荧光标记的检测抗体,每孔100μL,室温孵育1小时,再次洗涤3-5次去除未结合抗体。
‌信号检测读数‌:加入对应显色/发光/荧光底物,按照检测方法要求孵育后,立即用酶标仪/化学发光仪读取信号值,根据标准曲线计算样本中靶标的浓度。
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