荧光定量PCR(qPCR)仪是分子生物学研究、临床诊断(如新冠病毒检测)等领域的核心设备，其准确性直接影响实验结果的可靠性。校正(校准)是确保qPCR仪性能稳定的关键步骤，需定期对温控系统(温度控制精度)和光学系统(荧光信号检测)进行系统性验证与调整。
一、校正的核心目标
qPCR仪的校正旨在确保以下关键性能指标符合要求：
温控系统：温度示值误差(设定温度与实际温度的偏差)、温度均匀度(反应孔间温差)、温度波动度(温度随时间的变化)、温度最大过冲量(升温/降温过程中超出设定值的幅度)、平均升降温速率(升温/降温的速度)。
光学系统：荧光强度精密度(同一孔荧光信号的一致性)、阈值循环数(Ct值)精密度(不同孔Ct值的一致性)、熔解温度(Tm值)漂移(荧光强度下降一半时的温度偏差)、荧光线性相关系数(荧光强度与核酸浓度的线性关系)。
二、校正前的准备工作
1. 环境条件
温度：15–30℃(避免温度波动影响校准结果)；
相对湿度：20–85%RH(防止仪器受潮)；
电源：稳定电压(建议使用UPS)，避免断电影响校准进程。
2. 设备与材料
标准物质：需使用有证标准物质(如质粒DNA、核糖核酸标准物质)，其特性量值(拷贝数≥10⁶ copies/μL)及相对扩展不确定度(≤5%)需符合JJF(津)04-2020要求；
校准设备：光学模拟器(集成温度传感器与发射光发生器，温度测量范围0–120℃，最大允许误差±0.1℃；发射光波长360–780nm，相对光辐射强度可调)、多通道温度校验仪(如JDPC-96，用于测量反应孔间温差)；
耗材：专用校准板(如AB7500 ROI校准板、背景校准板)、移液器(2μL、10μL等，需计量检定合格)、无粉手套(防止污染校准板)。
三、校正的主要流程
qPCR仪的校正流程需严格遵循JJF(津)04-2020《实时荧光定量PCR仪校准规范》，主要包括温度系统校准与光学系统校准两部分，以下以AB7500系列仪器为例说明具体步骤：
（一）温度系统校准
温度是qPCR反应的核心参数，直接影响DNA扩增效率。温度系统校准需使用光学模拟器(替代反应管)，模拟实际反应中的温度变化，验证仪器的温度控制性能。
1. 校准前准备
将光学模拟器与qPCR仪连接，确保下方温度传感器与上方荧光发射光源与仪器均热块接触良好；
在光学模拟器下涂抹导热油，增强热传导；
打开仪器软件，选择“校准”模块，进入“温度校准”程序。
2. 校准程序
预热：设定仪器温度为23℃，运行预热程序(约10分钟)，使仪器达到稳定状态；
温度点设置：选择9个温度点(30℃、50℃、60℃、70℃、90℃、95℃等)，每个温度点持续2分钟(用于测量温度示值误差、均匀度、波动度)；
升温/降温过程：从50℃升温至90℃(测量平均升温速率)，再从90℃降温至50℃(测量平均降温速率)；
数据采集：仪器自动记录每个温度点的设定温度(Ts)、实际温度平均值(T₁)、温度波动值(T_v)、最大过冲值(T_os)。
3. 结果计算
温度示值误差：△T = Ts - T₁(要求≤±0.5℃)；
温度均匀度：△Tu = T_umax - T_umin(T_umax为所有孔温度最大值，T_umin为最小值，要求≤1.0℃)；
温度波动度：△T_v = ±(T_max - T_min)/2(T_max为单个孔温度最大值，T_min为最小值，要求≤0.2℃)；
温度最大过冲量：△T_os = Tosmax - Ts(Tosmax为所有孔过冲值最大值，要求≤3.0℃)；
平均升温速率：v_up = (TB - TA)/tut(TB为90℃温度点平均值，TA为50℃温度点平均值，tut为升温时间，要求≥4℃/秒)；
平均降温速率：v_down = (TB - TA)/tdo(tdo为降温时间，要求≥3℃/秒)。
（二）光学系统校准
光学系统负责检测荧光信号，其准确性直接影响Ct值与核酸浓度的定量结果。光学系统校准需使用专用校准板(如AB7500 ROI校准板)，调整荧光检测器的灵敏度与信号一致性。
1. 背景校准
目的：消除仪器本底荧光(如电子信号、塑料耗材污染)的干扰；
步骤：
(1)取出背景校准板(需室温放置5分钟，避免冷凝水)；
(2)将校准板装入仪器，运行“背景校准”程序(约30分钟)；
(3)软件自动记录背景荧光信号，生成背景校正文件(后续实验中自动扣除)。
2. ROI（感兴趣区域）校准
目的：将反应板上的孔位映射到仪器检测器，确保每个孔的荧光信号准确采集；
步骤：
(1)取出ROI校准板(标准板或快速板，需涡旋5秒并离心2分钟)；
(2)将校准板装入仪器，运行“ROI校准”程序；
(3)软件自动拍摄每个滤光片的图像，生成ROI掩码(每个孔周围显示绿色圆圈，表明校准成功)；
(4)若图像过饱和(孔内荧光过强)，需调整曝光时间(如从2048减少至1024)，重新采集图像。
3. 光学校准
目的：补偿光学系统的物理效应(如滤光片的光谱响应)，确保荧光信号的准确性；
步骤：
(1)选择“光学校准”程序，加载ROI校准文件；
(2)运行程序(约10分钟)，软件自动分析荧光信号的光谱特征，生成光学校正文件。
4. 染料校准
目的：验证不同染料(如FAM、VIC、ROX)的荧光信号准确性，确保多染料实验的可靠性；
步骤：
(1)取出染料校准板(包含多种荧光染料，如CY3、CY5、FAM等)；
(2)将校准板装入仪器，运行“染料校准”程序；
(3)软件自动采集每个染料的荧光光谱，生成染料校正文件(后续实验中自动识别染料信号)。
（三）结果记录与证书
校准完成后，需出具CNAS认证的校准证书，包含以下内容：
(1)仪器基本信息(型号、序列号、生产厂家)；
(2)校准环境条件(温度、湿度、时间)；
(3)校准结果(温度示值误差、均匀度、光学系统精密度等)；
(4)校准人员与审核人员签名；
(5)校准机构资质(CNAS认可编号)。
四、校正的注意事项
1. 校准周期
建议每12个月进行一次全面校准(符合JJF(津)04-2020要求)；
高使用频率(如每天运行10次以上)或关键应用(如临床诊断)下，可缩短至6个月一次；
仪器搬迁、维修或更换关键部件(如加热块、检测器)后，需重新校准。
2. 专业支持
校准需由厂家工程师或具备资质的第三方机构(如天津市计量监督检测科学研究院)执行，确保符合SOP(标准操作程序)；
禁止非专业人员自行调整仪器参数(如温度设置、光学滤光片)，以免影响校准结果。
3. 校准后的验证
校准完成后，需运行标准物质验证实验(如质粒DNA标准物质)，检测Ct值的重复性(变异系数≤3%)与线性相关系数(R²≥0.99)，确保校准效果；
若验证结果不符合要求，需重新校准或联系厂家维修。
五、常见问题与解决
1. 温度均匀度不符合要求
原因：均热块污染(如残留的PCR产物)、温度传感器老化；
解决：清洁均热块(用无水乙醇擦拭)，更换温度传感器。
2. 荧光信号强度低
原因：ROI校准失败(孔位映射错误)、背景荧光过高；
解决：重新进行ROI校准，运行背景校准(更换背景校准板)。
3. Ct值变异大
原因：温度波动度超标(如加热块不稳定)、荧光检测器灵敏度下降；
解决：检查加热块的温度稳定性(用多通道温度校验仪测量)，更换荧光检测器。
六、总结
荧光定量PCR仪的校正是确保实验数据准确可靠的关键步骤，需严格遵循行业标准(如JJF1527-2015、JJF(津)04-2020)，定期对温控系统与光学系统进行校准。校准过程中需注意环境条件、专业支持与结果验证，确保仪器的性能符合实验要求。通过规范的校正流程，可有效减少实验误差，提高qPCR结果的准确性与重复性。
